本次“旅行”咱們繼續(xù)來流式技術(shù)的世界里遨游，今天跟各位旅行家去探訪流式世界的老牌強者——質(zhì)譜流式。之前咱們一起游覽了光譜流式“景區(qū)”，屬于新生力量，質(zhì)譜流式的出現(xiàn)比全光譜流式早幾年，在細胞多色檢測領(lǐng)域，質(zhì)譜流式是絕對的前輩”高人“。
流式細胞術(shù)從20世紀60年代末開始，成為細胞研究的重量級工具。但因為熒光素光譜重疊問題，能同時研究的標記物數(shù)量有限，這大大限制了它在復(fù)雜生物體系研究中的應(yīng)用。就在這個背景下，質(zhì)譜流式應(yīng)“需”而生。在全光譜流式還未出現(xiàn)的日子里，研究人員想要深入了解細胞的深層秘密，質(zhì)譜流式就是他們唯一的依靠。不過，那時候質(zhì)譜流式的儀器和試劑都價格不菲，可以說是流式界的“貴”族。但現(xiàn)在不一樣了，咱們國產(chǎn)廠商開始在這個領(lǐng)域發(fā)力，質(zhì)譜流式會越來越親民，性價比更高。
咱還是老規(guī)矩。先給各位旅行家瞅瞅今兒這場 “探訪之旅” 的攻略是咋安排的。這第一站呢，咱就去扒一扒質(zhì)譜流式的發(fā)展歷程。接著第二站，就深入探究下到底啥是質(zhì)譜流式，順便把它的工作原理也搞清楚，揭開它神秘的面紗。到了第三站，咱再去市場上逛逛，瞅瞅都有哪些質(zhì)譜流式的產(chǎn)品在 “爭奇斗艷”。Go！馬上開啟今天這場超有趣的探索之旅！
第一站：質(zhì)譜流式的發(fā)展簡史
說起質(zhì)譜流式，就如同文章標題里講的那般，恰似質(zhì)譜和流式之間一場美妙又浪漫的邂逅。至于流式的過往，咱和各位旅行家之前可都已經(jīng)詳細的聊過啦。剛加入咱們旅途的旅行家，可以去瞅瞅流式之眼的開頭三篇與“與大家的聊天記錄”，本篇就不重復(fù)嘮叨了。接下來，就從質(zhì)譜這兒開始講起。為啥從這開始？因為質(zhì)譜流式細胞術(shù)這個厲害的技術(shù)，原本就是在質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上衍生發(fā)展而來的。
1.質(zhì)譜(Mass)技術(shù)的誕生：
這里我們通過兩個在質(zhì)譜領(lǐng)域有著極大貢獻的科學(xué)家來看質(zhì)譜技術(shù)的起源。
第一位叫做阿瑟·杰弗里·登普斯特（ Arthur Jeffrey Dempster），他第一臺現(xiàn)代質(zhì)譜儀的發(fā)明者，于 1918 年建造了世界上第一臺質(zhì)譜儀（圖1-1），能夠分離并精確測量不同帶電粒子的質(zhì)量，對于研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)和同位素分析具有劃時代的意義。
第二位叫弗朗西斯·威廉·阿斯頓（Francis William Aston），他在1919年首次制成了聚焦性能較高的質(zhì)譜儀（圖1-2），并用此來對許多元素的同位素及其豐度進行測量，肯定了同位素的普遍存在，還提出了元素質(zhì)量的整數(shù)法則，因此榮獲了 1922 年的諾貝爾化學(xué)獎。
2.質(zhì)譜流式的誕生及商品化：
因為有了前輩們的不懈努力和卓越貢獻，質(zhì)譜技術(shù)才能如同茁壯成長的樹苗，一路蓬勃發(fā)展。時間轉(zhuǎn)瞬即逝，到了 2009 年。在這個時期，傳統(tǒng)的熒光流式技術(shù)其實已經(jīng)取得了相當大的進步，在很多方面都有了顯著的提升。然而，任何技術(shù)都會面臨其局限性，傳統(tǒng)熒光流式由于技術(shù)條件的限制，始終無法有效地避免熒光素光譜相互重疊，這就導(dǎo)致了當時細胞多參數(shù)檢測最多就只能同時檢測 18 個熒光參數(shù)，很難再繼續(xù)拓展。
為了解決這個問題，多倫多大學(xué)的Tanner 團隊另辟蹊徑，他們基于發(fā)展成熟的高靈敏的質(zhì)譜檢測技術(shù)，用穩(wěn)定的金屬同位素標記探針替代傳統(tǒng)的熒光分子，結(jié)合敏感且高參數(shù)的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）免疫分析技術(shù)與流式的液流系統(tǒng)，于2009年創(chuàng)造出了全新的單細胞分析平臺--質(zhì)譜流式系統(tǒng)，命名為CyTOF，成功的避免了熒光素光譜重疊問題, 這一突破使得在單細胞水平上同時檢測超過 40 個參數(shù)成為可能，開啟了高維單細胞分析的新時代。
緊接著加拿大DVS Sciences 公司將CyTOF商品化，同年推出世界首款CyTOF質(zhì)譜流式系統(tǒng)：CyTOF 1(圖1-3)，
圖1-3.CyTOF 12013年DVS Sciences 公司又推出升級版的CyTOF2（圖1-4）。
2014 年，美國Fluidigm（富魯達）公司收購了 DVS Sciences 公司和 CyTOF 技術(shù)。此后，質(zhì)譜流式技術(shù)開始了高速發(fā)展，Fluidigm不斷改進質(zhì)譜系統(tǒng)，相繼推出了Helios（CyTOF3）、CyTOF XT 。2022 年 4 月Fluidigm獲得 Casdin Capital 和Viking Global Investors 的 2.5 億美元投資后，更名為 Standard BioTools（思百拓）。
3.國產(chǎn)質(zhì)譜流式的發(fā)展：
這里要特別說一下質(zhì)譜流式國產(chǎn)化發(fā)展，在這一充滿挑戰(zhàn)的征程中，有幾家國內(nèi)公司那可真是不得不提。上海宸安生物是國內(nèi)第一家吃螃蟹的，2016 年開始成立研發(fā)團隊，2021 年上市了首款質(zhì)譜流式儀 ——Starion 星瀚系列，這是全球第二套、國內(nèi)第一套質(zhì)譜流式系統(tǒng)。到 2023 年，宸安生物Starion M1.0 拿到了醫(yī)療器械注冊證，這是全球第一臺被批準用于體外診斷的質(zhì)譜流式。同年，普羅亭科技的第一款質(zhì)譜流式儀 PLT-MC601 上市并取得了醫(yī)療器械注冊證，在臨床和科研領(lǐng)域同時發(fā)布。還有譜康醫(yī)學(xué)的 MSFLO也發(fā)布上市，這些公司在質(zhì)譜流式這一塊兒都不含糊，不光讓中國智造在國際上更有面子，還把質(zhì)譜流式從設(shè)備到試劑的成本都拉下來了，設(shè)備比有些高端熒光分析流式還便宜，金屬標簽抗體價格也變得親民，質(zhì)譜流式不在遙不可及，“舊時王謝堂前燕，飛入尋常百姓家”。
第二站：什么是質(zhì)譜流式，優(yōu)勢，原理及實驗流程
上一站我們一同領(lǐng)略了質(zhì)譜流式的發(fā)展征程。這一站，我們就要引領(lǐng)著各位充滿探索精神的旅行家，揭開質(zhì)譜流式那神秘面紗的一角，深入探尋它究竟是怎樣巧妙地施展 “魔法”，從而實現(xiàn)細胞多參數(shù)檢測這一神奇而關(guān)鍵的過程，去發(fā)掘隱藏其中的獨特奧秘與精妙機制。
1.什么是質(zhì)譜流式
質(zhì)譜流式（Mass Cytometry，MC）巧妙融合了流式細胞術(shù)精準的單細胞分析專長以及質(zhì)譜技術(shù)所具備的高靈敏度與卓越的多參數(shù)檢測優(yōu)勢，其使用金屬同位素標記的抗體，首先將細胞樣本進行霧化，使之成為能夠被質(zhì)譜儀敏銳捕捉的離子云形態(tài)。隨后，依據(jù)質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio）這一關(guān)鍵指標，對這些離子進行精細的分離與精準的檢測操作，進而達成對細胞多重參數(shù)的精確定量分析。這種創(chuàng)新性的技術(shù)手段，使得質(zhì)譜流式在單個細胞水平上能夠一次性同步檢測多達 40 種以上的各類分子標志物
2.質(zhì)譜流式優(yōu)勢
多參數(shù)分析：能夠同時檢測多種生物分子，提供更全面的細胞信息，有助于深入了解細胞的功能和狀態(tài)。
高靈敏度：可以檢測到低豐度的生物分子，對于研究稀有細胞群體和細胞內(nèi)微量蛋白質(zhì)的變化具有重要優(yōu)勢。
抗串擾能力強：通過使用金屬標簽作為標記物，避免了熒光標記中常見的光譜重疊和背景信號問題，具有較強的抗串擾能力。
3.質(zhì)譜流式檢測原理
質(zhì)譜流式巧妙地運用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）與時間飛行質(zhì)譜（TOF-MS）技術(shù)的相得益彰，通過對特異性地與金屬標簽緊密結(jié)合的抗體進行精準檢測，以一種高度精確且高效的方式，達成了在單細胞的微觀層面上，對多種生物分子展開同步的量化分析，其過程如下：
(1)細胞霧化
樣品引入：細胞在被引入質(zhì)譜儀時被霧化成微小的 droplets（液滴）,這個過程將含有金屬標簽抗體或其他細胞探針標記的單細胞懸液引入等離子體炬中（圖2-1）。
(2)細胞離子化
a.這些液滴隨后進入電感耦合氬等離子體（ICP）中，在高溫和高頻電場的作用下，細胞內(nèi)的共價鍵被斷裂，原子和離子被釋放出來。這個過程是使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）（圖2-2）進行，ICP-MS 是一種用于分析元素組成和含量的儀器技術(shù)。在質(zhì)譜流式中，ICP-MS 用于將與金屬標簽結(jié)合的細胞探針中的金屬元素離子化，并根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對其進行分離，為后續(xù)TOF-MS提供了元素特異性的檢測信號。
b.等離子體作用：在高頻感應(yīng)耦合等離子體的高溫環(huán)境（約 6000 - 10,000 K）下，樣品中的金屬元素被原子化和離子化，形成金屬離子（圖2-3）。
(3)離子過濾與富集
產(chǎn)生的離子云通過真空錐接口進入四極離子偏轉(zhuǎn)器，采用四極桿按照離子的質(zhì)荷比（m/z）對離子進行過濾并富集，去除常見的生物元素離子，只富集含有目標金屬報告離子（根據(jù)質(zhì)荷比大小）的部分（圖2-4）。這樣可以提高后續(xù)質(zhì)譜分析的準確性和特異性，只檢測與抗體結(jié)合的重金屬標記的蛋白質(zhì)離子。
(4)時間飛行質(zhì)譜質(zhì)譜檢測
富集后的離子云被送到時間飛行質(zhì)譜儀（TOF-MS）中，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對離子進行分離和檢測，不同質(zhì)荷比的離子在飛行時間上有所差異，TOF-MS 用于對經(jīng)過 ICP-MS 離子化后的金屬離子進行精確測量，實現(xiàn)了對不同金屬標記的生物分子的準確識別和定量，過程如下（圖2-5）：
離子加速與飛行：離子從離子源中被引出后，進入一個高電場區(qū)域，被加速飛向檢測器。離子的飛行速度與其質(zhì)荷比成正比，質(zhì)荷比越大，飛行速度越慢，因此通過測量離子的飛行時間，可以計算出離子的質(zhì)荷比。
飛行時間檢測：離子在飛行過程中，通過飛行時間探測器對其進行檢測。探測器記錄離子到達的時間，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，與相應(yīng)的質(zhì)荷比進行關(guān)聯(lián)。
數(shù)據(jù)采集：TOF-MS 可以在短時間內(nèi)對大量離子進行快速測量，從而實現(xiàn)對單細胞內(nèi)多種金屬標記的生物分子的同時檢測和定量分析。
4.質(zhì)譜流式實驗流程
了解了質(zhì)譜流式的檢測原理之后，再讓我們帶各位旅行家看看從細胞制備到質(zhì)譜流式上機的完整檢測流程（圖2-7）。
Step1.細胞采集與準備：整個分析流程的第一步，獲取單細胞懸液，以實現(xiàn)單細胞標志物的分析，與傳統(tǒng)熒光流式處理方式及要求一致。
Step2.抗體孵育與細胞處理（圖2-6）：將單細胞懸液與帶有金屬標簽的抗體進行孵育。抗體與細胞內(nèi)的目標蛋白質(zhì)結(jié)合，形成抗體 - 蛋白質(zhì)復(fù)合物，以便后續(xù)的檢測。如果要檢測胞內(nèi)的靶標，則需要進行細胞破膜（permeabilization）處理。通常使用化學(xué)物質(zhì)或物理方法破壞細胞膜，使抗體能夠進入細胞內(nèi)，與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，除了使用的是帶有金屬元素標簽的抗體，過程與傳統(tǒng)熒光流式的檢測流程也無差別。
Step3.使用質(zhì)譜流式檢測（詳見3.質(zhì)譜流式檢測原理）。
Step4.數(shù)據(jù)收集與分析：收集到的數(shù)據(jù)被編譯成 FCS 文件，包含了每個細胞在質(zhì)譜分析中獲得的每種標記的金屬離子信號強度。FCS 文件可以使用各種流式數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，可以對數(shù)據(jù)進行處理、統(tǒng)計分析和可視化展示，例如繪制細胞群體的直方圖、散點圖、聚類圖等，幫助研究人員理解細胞的特征和分布情況，揭示細胞之間的差異和關(guān)系。
通過這段探索，穿越質(zhì)譜流式的技術(shù)長廊，各位旅行家想必此時已然對質(zhì)譜流式的原理有了更透徹的了解。曾經(jīng)籠罩在質(zhì)譜流式之上的那層神秘面紗，此刻已然被輕輕揭開，以一種親切而明晰的姿態(tài)，展現(xiàn)在各位旅行家的面前。
第三站：目前市場上有哪些質(zhì)譜流式的產(chǎn)品
領(lǐng)略完質(zhì)譜流式的精妙原理之后，各位充滿探索欲的旅行家們，想必此刻心中都懷揣著對當下市場中商品化產(chǎn)品的好奇與期待吧？如今市場之中，質(zhì)譜流式產(chǎn)品恰似那春日里生機勃勃的竹筍，層出不窮且日益豐富多樣，那么，事不宜遲，接下來，就讓我們一起瞅瞅，如今到底有哪些 “寶藏” 產(chǎn)品可供挑選（如有錯誤或者遺漏，歡迎各位旅行家留言或者私信指正），出場順序就按照產(chǎn)品大致上市時間排序。
1.CyTOF XT 質(zhì)譜流式系統(tǒng)（圖3-1）
上市時間：2021 年 5 月 25 日
生產(chǎn)廠商：Standard BioTools（思百拓）（原名Fluidigm）
產(chǎn)品特點：具備135個檢測通道，目前可以實現(xiàn)一管內(nèi)50多個標志物進行多參數(shù)分析，選配自動化上樣和采集。
2.Starion 星瀚系列質(zhì)譜流式（圖3-2）
上市時間：2021年
生產(chǎn)廠商：上海宸安生物
產(chǎn)品特點：具備140個獨立檢測通道，目前可以實現(xiàn)40色及以上標志物檢測，具有臨床醫(yī)療器械注冊證。
3.Lunarion 質(zhì)譜流式細胞分析儀（圖3-3）
上市時間：2022年12月
生產(chǎn)廠商：上海宸安生物
產(chǎn)品特點：具備140個獨立檢測通道，目前可以實現(xiàn)40色及以上標志物檢測，內(nèi)置高通量自動進樣器，樣本倉可控溫，有臨床醫(yī)療器械注冊證。
4.MSFLO質(zhì)譜流式細胞分析儀（圖3-4）
上市時間：2023年
生產(chǎn)廠商：譜康醫(yī)學(xué)
產(chǎn)品特點：采用垂直炬管設(shè)計，垂直引入反射式飛行時間質(zhì)量分析器，具備全通、帶通、單通三種工作模式的多模式四極桿。
5.PLT-MC601質(zhì)譜流式細胞分析儀（圖3-5）
上市時間：2023年8月生產(chǎn)廠商：普羅亭
產(chǎn)品特點：有130個檢測通道，具備臨床醫(yī)療器械注冊證，可以用于臨床檢測。圖3-5.PLT-MC601 質(zhì)譜流式細胞分析儀
6.MC-801系列質(zhì)譜流式（圖3-6）
上市時間：2024 年 11月
生產(chǎn)廠商：普羅亭產(chǎn)品特點：具有140個檢測通道，有樣本自動進樣器，支持樣本冷卻控溫。
可以看到當下質(zhì)譜流式產(chǎn)品的可選種類已然較為豐富多樣了。盡管相較于熒光流式而言，其種類數(shù)量或許尚有差距，但是隨著質(zhì)譜流式技術(shù)的發(fā)展，尤其更多金屬標簽的開發(fā)，未來可期。
總結(jié)：
現(xiàn)今，全光譜流式技術(shù)的發(fā)展迅猛，相比較在一定程度上質(zhì)譜流式的發(fā)展確實減緩了，但質(zhì)譜流式恰似一位底蘊深厚的 “高手”，歷經(jīng)漫長歲月打磨自身的技術(shù)，賦予了它出色的檢測穩(wěn)定性，這無疑是其作為老牌強者所擁有的顯著優(yōu)勢，更為關(guān)鍵的是，質(zhì)譜流式的高靈敏度、高分辨率以及高準確性，可以對單細胞進行深度剖析，這種強大的分析能力在目前的細胞多色檢測領(lǐng)域中依舊極具競爭力，特別是在國產(chǎn)力量加入這一領(lǐng)域之后，通過不斷研發(fā)創(chuàng)新，使儀器在性能提高的同時，硬件和試劑成本下降，降低了使用門檻，大大增加了用戶的普及范圍，這一切都為質(zhì)譜流式的未來勾勒出充滿希望的畫卷，特別是質(zhì)譜流式衍生出的組織質(zhì)譜成像技術(shù)IMC（Imaging Mass Cytometry），目前在空間蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域有著絕對的優(yōu)勢，今天我們主要還是專注在流式方向，以后有機會跟各位旅行家聊聊個有趣的技術(shù)。
參考文獻：
[1]Mass Cytometry: Single Cells, Many Features, Cell. Matthew H. Spitzer and Garry P. Nolan,2016 May 5; 165(4): 780–791. doi:10.1016/j.cell.2016.04.019.
[2]Approaching Mass Cytometry Translational Studies by Experimental and Data Curation Settings, Teresa S. Hawley and Robert G. Hawley (eds.), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2779,https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3738-8_17,
[3]Mass Cytometry, Methods in Molecular Biology, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9454-0[4]Mass Cytometry: The Time to Settle Down, Antonio Cosma, Garry Nolan, and Brice Gaudilliere, Cytometry A. 2017 January ; 91(1): 12–13.doi:10.1002/cyto.a.23032.[5]https://cytoforum.stanford.edu/index.php
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